食物不耐受是机体免疫系统针对某种或多种食物产生的过度保护性的复杂变态免疫反应，并针对这些食物产生特异性IgG,引起全身组织（包括血管）发生炎症反应[1]，表现为全身各系统的症状或疾病。据报道IgG介导的食物不耐受在人群中的发病率约45% [2-3]，因缺乏明确的诊断标准， 临床多采用对症治疗，但由于长期反复发作，缺乏正确的治疗而引发器质性病变[4]。不耐受原是食物中能引发不耐受的关键蛋白，检测患者外周血中的特异性IgG进而推测不耐受原是诊断食物不耐受重要的体外试验方法。引发食物不耐受的成分中，蛋白种类很多，因此，鉴别不耐受食物的蛋白提取液中的不耐受组分和探索不耐受原的纯化方法具有重要理论价值和临床应用价值。
小麦及其制品是我国居民的主要食物，也是膳食蛋白的主要来源，已有研究称小麦不耐受发病率高达15%，有较高的病患率和漏诊率，且并发症状较多，严重影响了患者的生活，它已经是食品健康领域的一个重要挑战。因此，检测人群中小麦蛋白IgG 抗体水平及引起小麦不耐受的成分有较大的意义。本文以小麦蛋白提取液为抗原，通过酶联免疫吸附试验对122例天津市南开医院体检人群血清中特异性IgG进行分析，并选取特异性IgG含量较高的阳性血清，通过酶免疫印迹技术分析引起小麦不耐受的蛋白组分。
1.材料与方法
材料
1.1.1 临床标本 随机选取2014年6月至2014年7月在天津市南开医院进行体检的122例血清标本，其中男性54例（44.26%），女68例（55.74%）。
1.1.2 重要仪器 96 孔酶标反应板（美国Costar 公司），Allegra 64R型低温高速冷冻离心机（Beckman 公司），EXL-800型酶标分析仪（Biotek 公司），垂直电泳槽及转印槽（BioRad 公司）。
1.1.3主要试剂 辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgG抗体（SouthernBiotech），碱性磷酸酶（AP）标记的抗人IgG 抗体（Jackson），蛋白包被液（0.01M pH 7.2 PB），样本稀释液（0.01M pH 7.4 PBS），胎牛血清（Gibco）。
1.2方法
1.2.1小麦蛋白提取物的制备 采用乙醇-丙酮提取法
称取300mg小麦洗净粉碎处理，将得到的面粉于40ml离心管中，加15ml的70%乙醇，制成悬浮液，于室温提取30min,期间不断摇动，4000r/min,离心5min(0℃)，得到的上清液中经丙酮提取后，分装置于零下20℃冰箱内保存，备用。
1.2.2 SDS-PAGE 分析小麦蛋白质组分
将提取的小麦蛋白液分别以1:4,1:8，1:12，1:16 的比例稀释，每孔上样15μl。堆积胶电压为65 V，分离胶电压为135 V，电泳时长1.5 h，考马斯亮蓝R-250 染色2 h后，充分脱色。用凝胶成像系统SDS-PAGE 电泳图进行图像分析，根据相对分子质量Marker 测定蛋白质相对分子质量。
1.2.3 酶标反应板的制备
⑴面粉蛋白提取物用包被缓冲液（0.01mol/L pH7.2 PB）以1:750 比例稀释，包被96 孔微孔板，每孔150 μl，室温过夜。次日用洗液（0.01mol/LpH7.2 PBST）洗涤3次。每孔加250 μl 封闭液（含10% 小牛血清），室温过夜。次日洗涤3 次，密封置4 ℃备用。
1.2.4 血清特异性IgG 检测
将待检血清1∶25 倍稀释，加入包被好抗原的微孔板中，每孔100 μl。在37 ℃条件下温育1 h，弃去反应液，洗涤5 次并拍干。加入HRP-抗人IgG 抗体工作液， 每孔100 μl。37 ℃温育30 min，弃去反应液，洗涤5 次并拍干。每孔加入A、B 底物各50 μl，37 ℃温育10 min，加终止液50 μl 终止反应。用Biotek EXL-800 酶标仪测定在450 nm 处的吸光度值（A450 nm）。
1.2.5 临界值的确定
对照组：选取40例无任何食物不良反应史和过敏史，且近3个月身体无过敏及消化系统症状的人，该人群来自天津市南开医院体检者。测定其血清A450 nm值，取其A450 nm平均值。依据文献[5] 确定其A450 nm平均值的3 倍为临界值（cut off，CO）。A450 nm nm>cut off 值为阳性，A450 nm大于平均值的5倍为强阳性。
1.2.6 小麦蛋白不耐受组分检测
